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哺乳動物體細胞核移植技術研究進展

時間:2015-01-14 16:54:10  來源:  作者:劉 亞; 章孝榮

1 體細胞核移植(克隆)的概念及其研究意義 體細胞核移植(克隆)是指成體動物細胞核經顯微手術和細胞融合的方法移植到去核的卵母細胞內或將體細胞核直接注入到去核卵母細胞質中,重新組成胚胎并使之發育乃至產生子代。 克隆技術的研究不僅對胚胎學、細胞生物學、發育生物學等學科具有重大理論意義,而且已展示出廣闊的應用前景。在科研上,可以用克隆技術研究機體漸成變化,研究某種細胞的全能性、體細胞衰老和發育的某些特征、動物發育過程中基因表達的調控等。對實驗動物,遺傳的均質性是最為重要的因素,用體細胞克隆技術可獲得遺傳物質均一的同一個體的多個后代,從而可提供特殊需要的實驗動物。在畜牧業生產上,可以通過建立優良家畜的細胞系進行克隆動物生產,加快育種進程。在醫學上體細胞核移植技術可用患者本人的細胞培育出新組織,用于治療糖尿病、帕金森癥和神經損傷等多種疾病。目前已有兩家美國公司開始研究利用體細胞核移植技術生產人胚胎,希望大批生產治療疾病的干細胞。此外利用體細胞核移植技術還可復制瀕危的動物,保存和傳播動物物種資源。

2 細胞核移植的研究歷史 早在1938年德國胚胎學家Spemann曾將蠑螈受精后分裂前的卵用頭發從動物極到植物極縛成兩部分,但不完全分開,中間仍有胞質相通。結果發現有核的一半能分裂,另一半則不分裂,等分裂到4或16細胞期,將縛的頭發放松,讓一個核進入原來沒有核的部分,然后將發圈縛緊使兩半完全分開,結果兩半都能發育成正常胚,說明了這些細胞核在16細胞期每一個核的發育能力都是相等的,也是全能的。據此他在其名著《胚胎發育和誘導作用》中提出一種設想:如果能用細胞核移植的方法,將不同發育階段細胞的核移到無核的卵中,將對研究核質關系具有重要意義。 1952年英國學者Briggs和King首先在豹蛙實現了Spermann的預言,他們將豹蛙囊胚頂部細胞的核移到去核的卵中,約有一半的重構卵能分裂并發育為部分或完整的囊胚。以后各國學者都相繼在不同種兩棲類中展開了同種的胚胎細胞核或成體細胞核移植方面的研究,都可獲得正常子代。 1963年,童第周等首次報道了魚類細胞核移植,在國際上首創移核魚和培育魚類新品種的一個新方法。 1981年Illmensee和Hoppe通過直接注射法把小鼠內細胞團細胞引入合子中后去核,生出了小鼠,這是首次哺乳動物細胞核移植成功的報道,但這項研究未能被重復出來,因而未能得到普遍承認。1983年,Mc-Grath和Solter采用新方法取得了合子核互換成功。隨后,各國學者們開始對多種哺乳動物進行胚胎細胞核移植研究,并取得了豐碩成果。 1996年,英國學者Campbell用分離的9日齡綿羊胚盤細胞在體外培養建立細胞系,然后用此細胞系細胞作供體,以綿羊棄核卵母細胞為受體構建核移植胚,經移植后獲得成活后代,這是世界首例以傳代細胞為供體獲得成活后代,也是從胚胎細胞核移植向體細胞核移植的一個關鍵性過渡。一年后,他的同事Wilmut將來自6歲綿羊的乳腺上皮細胞移人去核的卵母細胞后,得到世界上第一頭體細胞核移植后代--"Dolly",這是生物學史上一個里程碑式的事件,掀起了哺乳動物體細胞核移植研究高潮。

3 哺乳動物體細胞核移植技術研究現狀 克隆綿羊Dolly的問世,不僅給人們的觀念帶來了很大的改變,而且由于克隆技術所蘊藏的商業和社會價值,在全世界引起了轟動。世界許多實驗室都把研究方向轉到哺乳動物體細胞克隆上,并已在豬、牛、山羊、綿羊、小鼠、兔和貓等許多動物上獲得成功。其中研究最多最深人的還是牛,目前已用胎兒成纖維細胞、卵丘細胞、子宮細胞、輸卵管細胞、耳細胞、皮膚細胞、骨骼肌細胞、肝細胞、乳腺細胞及從初乳中獲得的乳腺上皮細胞等獲得了克隆后代。除了應用新鮮體細胞及卵母細胞進行體細胞核移植研究外,人們還對冷藏與冷凍保存的體細胞、卵母細胞或棄核并激活后的胞質體冷凍保存、克隆胚的冷凍保存的研究,對解決體細胞不能長期保存與應用的問題、屠宰淡季受體卵母細胞的供應問題及克隆胚的運輸、保存及與受體動物子宮環境同步化的問題起到促進作用。一些學者已報道凍存卵母細胞可支持核移植胚發育到期。還有學者報道玻璃化冷凍的卵母細胞用于核移植和新鮮卵母細胞一樣好。甚至有學者報道經血清饑餓進入靜止期的卵丘細胞在一70℃凍一融后立即進行核移植,重構胚卵裂率高達97%,顯著高于非冷凍細胞(85%)。 異種動物核移植也取得了令人矚目的進展。1999年,Tanja Diminko等證明去核的牛卵母細胞能使來自綿羊、豬、鼠、猴等不同種屬動物的細胞核在體外發育成胚胎。繼1999年獲得以牛卵母細胞為受體,以大熊貓體細胞為供體的重構異種囊胚之后,中科院動物所陳大元所領導的研究組又經兩年的努力,成功地使此異種重構胚在貓、犬及黑熊等動物子宮內附植(內部消息)。此外,中國南方一學者也于今年7月成功克隆出以兔卵母細胞為受體的人一兔重構胚。 對于克隆胚移植到受體后發育到期比例較低的原因,目前還不清楚,但據認為與胚胎分泌的IFN-tau水平較低、胎盤發育異常及核重編程不徹底等因素有關,而這些因素又可能與卵母細胞或重構胚的人工激活及重構胚的體外培養有關。因此,為將潛在的影響克隆成功率的因素降到最低,IrinaA等人在克隆豬時采用了二次核移植方案,即:用超排獲得的卵母細胞作為一級重構胚的核受體,在一級重構胚發育到原核期時再將其原核移入到棄原核的體內來源的原核期合子內,然后迅速移人受體母豬子宮內,從而減少了卵母細胞體外成熟、重構胚人工激活及重構胚體外培養對其發育潛力的不利影響。目前,用此方案所克隆出的5只仔豬已三個月,健康狀況都良好,可能與此改進的方案有關。但目前除豬、小鼠外,在其它動物尚未有人采用此方案。 但IrinaA等人在構建一級重構胚過程中仍采用了MII期棄核法,而目前已有實驗證明:TII期棄核效率卻顯著高于MII期。而且,由于TII期棄核吸除的胞質遠少于MII期棄核(分別為胞質容積的1/l0和1/3),使重構胚的囊胚發育率更高,質量更好。倘若在克隆豬的方案中采用TII期棄核法,其效率可能會更高。

4 目前存在問題 盡管克隆技術有著廣泛的應用前景,但離產業化尚有很大距離。因為作為一個新興的研究領域,克隆技術在理論和技術上都還很不成熟。在理論上,分化的體細胞克隆對遺傳物質重編(細胞核內所有或大部分基因關閉,細胞重新恢復全能性的過程)的機理還不清楚;克隆動物是否會記住供體細胞的年齡,克隆動物的連續后代是否會累積突變基因,以及在克隆過程中胞質線粒體所起的遺傳作用等問題還沒有解決。在實踐上,要想將其大規模應用于生產上,還有許多問題有待解決:其一,克隆胚經移植后發育到期并產下活仔的比例太低,總體不到l0%,威爾穆特研究組在培育"多莉"的實驗中,融合了277枚移植核的卵細胞,僅獲得了"多莉"這一只成活羔羊,成功率只有0.36%,同時進行的胎兒成纖維細胞和胚胎細胞的克隆實驗的成功率也分別只有1.7%和1.1%,即使是使用"檀香山"技術,以分化程度較低的卵丘細胞為核供體,其成功率也只有百分之幾。而大規模商業上應用所要求的受體妊娠率至少要達到50%(每個受體牛平均移植3枚克隆胚胎),這是最主要的問題;其二,新生仔畜的發育缺陷及死亡率或圍產期死亡率較高。以克隆牛為例,日本、法國等國培育的許多克隆牛在降生后兩個月內死去;到2000年2月,日本全國已共有121頭體細胞克隆牛誕生,但存活的只有64頭。觀察結果表明,部分犢牛胎盤功能不完善,其血液中含氧量及生長因子的濃度都低于正常水平;有些牛犢的胸腺、脾和淋巴腺未得到正常發育;克隆動物胎兒普遍存在比一般動物發育快的傾向,這些都可能是死亡的原因。即使是正常發育的"多莉",也被發現有早衰跡象。染色體的末端被稱為端粒,它決定著細胞能夠分裂的次數:每一次分裂端粒都會縮短,而當端粒耗盡后細胞就失去了分裂能力。1998年,科學家發現"多莉"的細胞端粒比正常的要短,即其細胞處于更衰老的狀態。當時認為,這可能是用成年綿羊的細胞克隆"多莉"造成的,使其細胞具有成年細胞的印記,但這一解釋目前受到了挑戰。美國馬薩諸塞州的Lanza R. P.博士等用培養的衰老細胞克隆牛,得到6頭小牛,出生5-10個月后發現這些克隆牛的端粒比普通同齡小牛要長,有的甚至比普通新生小牛的端粒還長。現在還不清楚這一現象的原因,也不清楚為何與"多莉"的情況有巨大差別。但這一實驗說明,在一些情況下克隆過程能改變成熟細胞的分子鐘,使其"恢復青春",關于這種變化對克隆動物壽命的影響,還有待于進一步觀察。

5 發展趨勢 目前科學家已利用體細胞核移植技術成功克隆廠多種動物,今后人們將不再以能克隆出某種動物為目的,而向更深層次研究--弄清已經分化的細胞核. DNA重新程序化的機理,從而能在根本上大幅度提高哺乳動物體細胞核移植成功率,降低克隆動物發育異常率,使之能夠真正廣泛應用到生產和科學研究上。 從瀕危動物保種方面考慮,異種動物體細胞核移植也是今后的重要發展方向。盡管到目前為止絕大多數學者對此研究的可行性仍持懷疑態度,但中國科學院動物所陳大元所領導的研究組目前所取得的進展無疑使人們看到了異種動物克隆成功的曙光,并將吸引更多學者從事這方面的研究。 到目前為止,生產轉基因動物的方法仍主要是1985年Hammer等建立的原核顯微注射法,外源基因整合進生殖細胞的機率低而難以遺傳給下一代。1998年AngelikaE.Schnieke等首先用轉染的胎兒成纖維細胞進行核移植產生表達人Ⅸ因子的轉基因羊,大大提高了轉基因的效率[463,2001年我國學者也利用體胞核移植法生產出綿羊轉基因囊胚。與轉基因技術相結合,進行轉基因克隆動物的生產既是目前大家的共識與研究熱點,也是今后體細胞核移植研究的一個發展方向。

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