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昆蟲重組桿狀病毒獲得技術研究展望

時間:2014-09-27 17:30:58  來源:  作者:李衛國; 王厚偉; 牟志美; 石連輝

自80年代初,發現桿狀病毒科核型多角體病毒的多角體蛋白基因(polh)的強啟動子特性后,SmithandSummers(1983)首次建立了苜蓿尺蠖核型多角體病毒(Autographa Califomica Naelear Polyhedrosis Vires,AeNPV)一秋粘蟲(Spodoptera frujiperda,sf)細胞桿狀病毒表達系統(Baeulovirus Expression Vectorsystem,BEVS)。利用家蠶可以大量飼養的特點,前田進于1984年建立了家蠶核型多角體病毒(BmNPV)一家蠶(Bombyxmoil)表達系統,至今已有上千個基因利用該系統進行了表達和功能分析。昆蟲桿狀病毒表達系統(Baeulovirus ExpressionVector System,BEVS)已成為當今基因工程領域四大表達系統之一,與大腸桿菌、酵母、哺育動物細胞表達系統相比,BEVS在以下四個方面具有特殊的研究價值:(1)作為超高效的真核基因表達載體,生產有用的工程蛋白;(2)作為基因工程病毒殺蟲劑,提高害蟲防治效率;(3)研究桿狀病毒基因組的結構與功能;(4)研究真核基因表達的調控機制。近幾年來,昆蟲桿狀病毒表達載體系統已成為生產與研究各種原核和真核蛋白的有力而普及的工具。

 1 研究進展 由于昆蟲桿狀病毒環狀雙鏈DNA基因組很大(約130kbp),而且對限制性內切酶都具有多個識別位點,因而不能用常規基因工程操作直接將外源基因導入到病毒基因組中。昆蟲重組桿狀病毒的獲得通常要分為兩步進行。第一步,把外源基因克隆進通用載體質粒中,使外源基因處于桿狀病毒強啟動子的控制之下,而且左右兩側被桿狀病毒DNA序列所包圍。這些側翼序列對病毒復制是非必需的,但在第二步同源重組時能發揮作用。第二步,把這一重組質粒DNA與野生型病毒基因組DNA一起導人昆蟲細胞,在細胞內通過同源重組把外源基因插入病毒基因組(外源基因置換了位于兩個側翼序列之間的野生型病毒基因組基因,如多角體蛋白基因),通過特定的篩選方法和篩選標記,即可篩選出目的重組病毒。但BEVS系統亦有重組率低,篩選困難,工作周期長等不足之處。針對這些缺點,圍繞著擴大BEVS的應用范圍、縮短工作周期等,近幾年從以下方面進行了研究改進。

1. 1 綠色熒光蛋白反向篩選標記系統 ?-半乳糖苷酶是一個常用的標志基因,Ayres曾用其構建了一個帶藍色白斑篩選的轉移載體,但?-半乳糖苷酶基因較大,同時它的底物x-gal對昆蟲細胞有一定的毒性,最近發現的水母綠色熒光蛋白(Green Flurescent Protein.GFP)及其特變體作為報告基因,具有檢測手段簡單,發光反應不需要其它蛋白和輔助因子及底物的參與,表達產物穩定等優點。已將其作為重組病毒的篩選標志引入桿狀病毒的研究。首先將GFP基因通過常規的篩選獲得GFP的重組病毒,以此作為親本病毒與帶有目的基因的相應轉移載體進行共轉染。純化時在熒光照射下,顯示綠色熒光的即為親本病毒,而不產生綠色熒光的則為GFP基因被目的基因替換掉的目標重組病毒。

1.2 非重組失活轉移載體篩選系統 Possee等發現,在多角體基因的下游存在一個病毒復制必需的基因ORF9(1629bp)。它編碼核衣殼的一個組分。而在多角體基因的上游有一個病毒自下而上所非必需的基因ORF603。通過上述工作,設計了非重組失活轉移載體。首先尋找一個在野生型病毒DNA上不存在酶切位點的限制性內切酶Bsu361,然而通過體外突變在ORF603和ORF9各引進一個Bsu36 1酶切位點,以此構建轉移載體,將上述酶切位點通過同源重組的方式引入病毒基因組,得到一個在ORF603和ORF9含有Bsu361酶切位點的突變型病毒株BacPAK6。將用Bsu36 I酶切的BacPAK6 DNA與帶多角體啟動子、目的外源基因和復制必需基因ORF8的重組轉移載體DNA轉染昆蟲細胞,若BacPAK6DNA自身.環化,則因缺失復制必需基因,病毒不能復制,只有重組病毒,亦即外源基因連同復制必需的基因重組到病毒DNA后,才能存活,重組率可高達80%或更高。但是病毒DNA經酶切線化后,其本身的感染力要比環狀病毒DNA降低15-150倍,降低了共轉染效率。

1.3 外源基因直接克隆產生重組桿狀病毒系統 在AeNPVe6株全序列測定分析的基礎上,發現病毒基因組上不含有I-ScaI酶切位點,I-scaI酶識別一個18bp的非回文對稱序列,(酶解后產生一個3'端突出的3'-AT-TT-5'粘性末端),一般外源基因中幾乎不可能有此位點存在。通過PVLl393轉移載體將此酶切位點引入AcNPV的病毒基因組。得重組病毒Ac-Omega.Acoomega經I-Sce I酶切及脫磷后,與外源片段以摩爾比1:40的比例在體外進行連接,然而將連接的混合液轉染昆蟲細胞,進行挑斑純化,分析表明,重組率達到95%以上。每微克病毒DNA可得到2x105個重組病毒"'。因此,此種方法非常適合于真核試驗生物載體的eDNA表達文庫和多肽文庫的建立。

1.4 酵母一昆蟲細胞穿梭載體篩選系統 Patel等發明了一種新的重組病毒篩選方法,主要原理基于在酵母中可以復制的桿狀病毒基因組DNA和包含了酵母DNA片段及外源基因的轉移載體在酵母Sacchromyces cerevisiae中發生重組,進而篩選出發生了重組的病毒DNA,重組病毒DNA經分離后轉染昆蟲細胞,形成重組病毒,表達外源基因。穿梭載體構建的主要過程如下:ARS為酵母的自主復制序列;CEN起有絲分裂中著絲粒的作用,保證質粒DNA能穩定地分配到子代酵母中去;URAB為選擇標記基因。首先通過同源重組將上述三個基因重組到病毒基因組,這種病毒DNA既可在酵母中復制,亦能在昆蟲細胞中復制。進而在酵母中將反選擇標記SUP4-0重組到病毒DNA上,形成最終的穿梭載體。在病毒基因組中多角體蛋白基因啟動子下游的基因排列順序為:多角體蛋白基因啟動子,SUP4-0,ARS,URA3和CEN。將上述穿梭載體的病毒DNA和外源基因的5'-端為桿狀病毒序列、3'-端為酵母ARS序列的轉移載體在酵母中發生重組,用外源基因替代SUP4-O基因。而缺失SUP4-O的重組穿梭載體能在含有精氨酸類似物刀豆氨酸(Canavanine)培養基的酵母中生長,因此只要選擇到抗Canavanine的酵母克隆,亦即等于篩選到了由多角體蛋白基因啟動子控制外源基因表達的重組病毒,省去了繁雜的挑斑過程。最佳情形可在10-12d獲得重組病毒。然而該法亦有以下缺點:由于S.cerevisiae的轉化頻率相對較低,且容易產生假Canavanine抗性,使抗canavanine酵母克隆的篩選較為費時。

1.5 體外重組表達載體篩選系統 噬菌體P1中含有一個特異性的重組系統Cre-Iox.Peakman,應用上述系統構建了體外重組表達載體系統。主要原理如下:噬菌體P1含有一個Cre重組酶,能特異性識別lox P序列,并與之發生重組。Lox P序列的特點為兩邊各有1個13bp的回文序列,中間被8bp回文結構隔開,將人工合成的LoxP序列通過同源重組轉移進NPV基因組,產生重組病毒NPV(lox P +),當含LoxP序列的外源基因的轉移載體DNA和NPV(10xP+)rDNA在體外經Cre重組酶的催化時,可發生位點特異性重組,重組率可高達50%,所以轉染細胞后,很容易篩選到重組病毒。這個系統由于易篩選到重組病毒,加之僅需一個步驟就能將外源基因從病毒基因組中分離出來。因此,可應用于eDNA文庫的構建。但這種方法篩選重組病毒會發生轉移載體(外源基因)多次插入到重組病毒及一些與外源基因表達無關的轉移載體DNA一并插入到重組病毒,可能對表達量有些影響。此外,該法依然需要挑斑試驗和重組病毒的純化,相對地較為費時。

1.6 大腸桿菌E.coli-昆蟲細胞的穿梭載體篩選系統 E.coli-昆蟲細胞穿梭載體(bacmid)是迄今為止最為方便、快捷的重組桿狀病毒篩選系統。Bacmid既能象質粒一樣在E.coli中復制,亦能象病毒一樣感染昆蟲細胞。Bacmid為一包含有mini-F復制子、卡那霉素抗性篩選標記和細菌轉座子Tn 7的靶序列att Tn7e及LacZ片段的重組病毒。 轉移載體的作用在此被貢獻質粒所取代。貢獻質粒設計為含抗慶大霉素基因和多角體蛋白啟動子控制的外源基因,兩側分別為tn7的左臂和右臂。同時為了產生位點特異的轉座,還需有一個輔助質粒(該質粒為四環素抗性篩選標志)提供轉座蛋白。因此,當將bacmid、貢獻質粒、輔助質粒轉化同一個菌株時,由輔助質粒產生的轉座蛋白,將抗慶大霉素基因和多角體蛋白啟動子控制的外源基因轉座到bacmid的att Tn7序列上,同時破壞了Lac-Z的閱讀框架,這樣只要將轉化上述質粒的菌株在含卡那霉素、四環素、慶大霉素及X-gal和IPTG的LB培養基上篩選白斑即可得到復合Bacmid,將復合Bac-midDNA純化后轉染昆蟲細胞,就得到了純的重組病毒,在昆蟲細胞中外源基因在多角體啟動子的控制下進行表達。 該系統是目前BEVS中最為方便、快捷的系統,整個重組病毒篩選的周期可縮短為7-10d,且可以連續篩選,因此十分適合于cDNA文庫的構建及蛋白質工程研究方面的應用。同時,貢獻質粒亦較常規的重組轉移載體為小,可以構筑較多的限制性酶切位點和進行改建,以利于外源基因的插入,且貢獻載體不僅能適用于BEVS中,亦能適合在其它真核生物表達系統中進行轉座,藝表達外源基因。由于轉座的免疫性,可以防止外源基因的多次插入。不足之處在于只有12.5kb的外源基因插入多角體蛋白基因位點,而且,插入后可能破壞了多角體啟動子工作環境,以致外源基因的表達量較之傳統的同源重組純化的重組病毒略有降低。

1.7 重組拯救缺陷型載體的研究 單純皰疹病毒I型的胸苷激酶基因(HSVl-TK)能催化核苷酸類似物成為DNA復制的抑制劑。因此,將HSVl-TK基因引入宿主細胞中以產生新的條件致死型。Gross等巧妙地應用TK基因的上述特性,開發了一種新的重組病毒篩選方法。研究發現在核苷酸類似物9-(1.3一,二地羥基-2丙氧甲基)鳥嘌呤(Ganciclovir)濃度直到100rug時并不影響sf-9細胞活力和AcMNPV野生型病毒的復制,將病毒的極早期啟動子(1E-1)啟動的HSVl-TK基因通過常規的同源重組技術引入Ac MNPV基因組獲得重組病毒Ac NPVIE-1-TK,而Ac MNPVIE-1-TK的復制以劑量依賴的方式受到Cancilovir的抑制。在2 uM濃度情況下即可明顯抑制AcMNPV IE-1-TK的復制,而在100 mM濃度時,則復制完全受阻。因此,將連接有目的外源基因的轉移載體和Ac MNPV IE-1-TK病毒DNA進行共轉染時,將子代病毒接種在含50uM Ganciclovir的細胞培養基生長的細胞進行邊疆培養,由于只有TK基因已經被目的外源基因所替換的病毒才能良好地生長。因此,只需一輪純化即可獲得目的重組病毒,成功率高達85%以上。雖然,該種方法與前法相比,依然需要一輪篩選,但獲得的重組病毒完全與常規相同,并不引起如多角體蛋白基因啟動子所處的上游和下游序列改變可能導致的外源基因表達量的降低。同時較一般的篩選法而言,要簡單快捷。通過上述工作,桿狀病毒的重組病毒獲得已成為日常遺傳工程操作。

2 研究方向

2.1 改進病毒載體構建外源基因高表達系統 桿狀病毒是控制森林害蟲密度的主要生物因子,病毒在進化過程中保留或獲得了一些非常有利于其繁殖和傳播的基因。如胱氨酸蛋白酶和幾個質酶,前者在病毒感染的晚期大量表達,分解蟲體的組織讓蟲體容易腐敗,從而利于在環境中傳播病毒,后者的大量表達,可以破壞蟲體的表皮幾丁質結構,使蟲體液化,達到在環境中大量擴散以利于再次感染。 然而這些基因能夠引起表達產物的降解,在活體表達中更能引起蟲體組織的潰壞,提前死亡,降低了表達量,增加了純化難度。貢成良等將BmNPV中的胱氨酸酶基因用半乳糖苷酶替代,以此為病毒表達載體,發病蠶體不易腐敗,發現外源基因在蠶體中的表達量得到了提高。 蛻皮甾體葡萄糖基轉移酶(egt)基因的編碼產物能使蛻皮激素失活,推遲幼蟲人眠,引起幼蟲持續取食和生長,增加了感染幼蟲的病毒繁殖量,利于病毒的進化。BmNPV中的egt基因敲除掉后,與經添食同樣量多角體的野生型BmNPV相比,幼蟲體重減輕,死亡時間提前了24h左右。顯示了egt被敲除掉的修飾病毒作為生物殺蟲劑的良好前景。 糖基化可以保護蛋白分子免受蛋白酶分解或維護蛋白質的天然構象,是后加工過程中的重要環節,昆蟲細胞的糖基化途徑有別于高等的哺乳動物細胞,桿狀病毒-昆蟲細胞所生產的糖蛋白明顯缺少N-連接的末端二個殘基分別為半乳糖和唾液酸的殘基的雙叉寡聚糖鏈。Jarvcss等針對桿狀病毒表達系統的上述缺陷,開發了一套新的表達系統,將糖基化修飾基因置于IE-1啟動子控制下,進行表達、修飾昆蟲細胞的N-糖基化途徑,為生產與哺乳動物細胞表達產物具有相同的N-糖基化蛋白提供了新途徑。當然現在利用IE-1啟動子的穩定化表達載體亦已建立,可將在昆蟲細胞缺少的有關糖基化酶穩定地轉化昆蟲細胞,用重組桿狀病毒在遺傳轉化修飾后的細胞表達N-糖基化要求高的外源產物,如人促紅細胞生成素,不失為一可行的途徑。

2.2 改進昆蟲細胞培養技術構建外源基因穩定表達系統 昆蟲細胞由于體積大,形狀較不規整,容易結團,加之病毒感染后細胞膨大1.5倍左右,這些因子增加了昆蟲細胞大規模培養的難度。目前已經建立的大規模昆蟲細胞培養形式有貼壁培養、懸浮培養和固定化培養等,其中貼壁培養又可分為滾瓶培養和微載體培養兩種;懸浮培養又可分為搖瓶和轉瓶,氣升式反應器和攪拌式生物反應器;固定化培養是近來發展的一項昆蟲細胞大規模培養新技術,對昆蟲細胞而言具有兩大優點:可有效降低剪切力對細胞的傷害,同時細胞與培液可有效分離,簡化了操作步驟,降低了染菌機率。它又可分為微囊化培養和堆積床法培養,其中堆積床法培養綜合了各種培養法的優點,昆蟲細胞貼壁生長在球狀顆粒上,并在氣升式反應器的降液區形成堆積床,而升液區則進行深層通氣供氧。堆積床法由于可提供高培養表面,同時又能保證充足的供氧,sf細胞用此法培養可達8.6x 107/ml(細胞),是目前的最高細胞培養密度。 在絕大多數情形,用昆蟲細胞生產野生型桿狀病毒或用BEVS生產外源蛋白質都是作為間歇過程進行的,所有細胞都因病毒感染而死亡。同時BEVS中外源基因的表達常在感染的晚期,高效表達的重組產物的后加工可能是不完全的。另一個明顯的缺點是經多次連續傳代后,病毒對昆蟲細胞的感染力降低,外源基因丟失,產生所謂的缺損病毒,使得連續培養的有效表達時間僅一個月,影響了表達效率。以上兩點難以克服的困難限制了昆蟲細胞規模化培養的發展,迫使人們尋求其它途徑,Jarvis應用病毒的極早期啟動子構建了一個穩定表達載體,用IE-1啟動子控新霉素基因選擇標記,b-gal和人的TPA基因分別作為外源基因表達的研究對象。穩定轉化的sf細胞可連續表達100代(一年)以上,b-gal的轉化細胞的表達量為2mg/L細胞,僅及用BEVS表達的1%。人的TPA是一種分泌型的糖蛋白,在BEVS中的表達量約為1mg/L細胞,且2/3的TPA留在細胞內,然而用穩定轉化細胞的TPA表達量大致與BEVS相同,且全部被細胞分泌出來,轉化細胞與被感染細胞的分泌速率比較發現,轉化子分泌TPA速度比病毒感染細胞快二倍,亦即昆蟲細胞被病毒感染后影響了sf細胞的分泌功能。最近的研究結果亦證實了上述論點,傳統的BEVS和穩定表達系統兩相比較來看,BEVS適于表達那些非分泌型的糖基化要求不高的表達產物,而穩定表達系統適于表達分泌型的后加工要求復雜的外源蛋白,將后者與無血清培養基開發和無蛋白培養基的開發相結合,不失為傳統BEVS的一個有效的補充。鑒于此一前景,最近Invitrogen開發了一個昆蟲細胞的穩定表達系統,對轉化細胞的選擇標記和啟動子作了改進。該系統的特點是用對昆蟲細胞具有很好殺死能力的Zeocin作為選擇標記,可以快速純化穩定轉化的細胞系,選用較強的黃彬毒蛾核多角體病毒(OpMNPV)的極早期基因啟動子IZ-2控制外源基因的表達,同時在外源基因的C端融合了易于檢測的v5抗原決定簇和便于純化的多聚組氨酸序列,據稱用此載體僅約兩周的時間就可獲得非裂解、連續表達的穩定轉化昆蟲細胞系。

2.3 開展自主式昆蟲宿主反應器的研究 BEVS系統的外源基因表達雖然表達量高,但它是瞬間的,不能連續高效表達外源產物,迫使人們考慮其解決途徑,家蠶絲腺是一個天然的高效生物反應器,每天最高可合成200rug絲蛋白,在短短的4-5d內積累的絲蛋白量可占整個蟲體蛋白質總量的70%左右,如此高效的蛋白合成和加工使其自然成為外源基因表達的生物反應器研究對象。桿狀病毒的m-1啟動子曾用于昆蟲細胞的穩定表達,類似的嘗試在家蠶中卻失敗了,因為外源質粒DNA進入卵后,被迅速地降解。在雙翅 目昆蟲果蠅中P因子是最常用的轉基因工具,在家蠶中P因子未顯示有轉移的能力,將目的基因高效導入蠶體內成為解決應用絲腺生物反應器的關鍵。張志芳(1993)等發現,AcNPV和重組AcNPV能在蠶蛹內復制并正確表達外源基因HBVSGg,而不顯示血液型膿病特有的病理現象;早期蛹注身AcNPV后,其egt基因的表達能夠誘導人工滯育蛹的形成,蛹期可達2個月之久,呈潛伏型感染。此種滯育蛹能被人工補助的蛻皮激素所激活。Mori(1995)等發現AcNPV能夠對家蠶經卵傳遞給子代,這均提示了利用AcNPV基因組作為同源重組的載體將外源基因引入家蠶基因組內的可能。最近Yamao用絲蛋白的輕鏈基因的外顯子7的上游5kb序列作為重組的長臂,下游0.5kb序列作為短臂,報告基因GFP插在兩者之間。整個嵌合的輕鏈-GFP基因,通過同源重組引入到AcNPV基因組的多角體蛋白基因區,5x105pfu重組AcNPV感染五齡起蠶,AcNPV選擇陽性子代進行純化固定,獲得了轉基因蠶,整合率在0.16%左右,測序及Southern雜交和Western分析的結果均表明,輕鏈-GFP嵌合基因已經定點整合在家蠶基因組并能正確表達。作為載體的AcNPV基因組只能在感染的當代和F1代能檢測到。重組AcNPV介導的外源基因技術提供了位點特異的家蠶基因敲除手段,為昆蟲基因的結構和功能,大量連續表達外源基因提供了可能。

3 應用前景 桿狀病毒表達系統自從問世以來,由于其不具有任何對哺乳動物有潛在的致病性的動物病毒片段,得到了人們的高度重視,美國食品藥品管理局對BEVS的評價為"FDA認可BEVS生產的產品,它提供了新興生物制藥業的前景,尤其對于人類疾病治療和疫苗的開發,改善人類的健康和提高數百萬人的生活質量更是如此。早在1987年,FDA就批準美國的Micro-gene Sys公司應用AcNPV表達系統生產的艾滋病基因工程疫苗進入臨床試用;在日本1993年就批準家蠶BEVS生產的貓用干擾素產品上市,銷售額每年達1000萬美元左右;在我國,上海生化所等應用家蠶BEVS生產的人促顆粒一巨噬細胞集落生化因子,顯示了良好的促白細胞生長功能,正在進行衛生部的藥檢審查。僅1999年農業部批準的BEVS表達產品有:武漢大學病毒系的重組蘇蕓金桿菌伴孢晶體毒素的桿狀病毒劑殺蟲進行中試,中國農業科學院蠶業研究所農業部家蠶生物技術重點開放實驗室的家蠶BEVS生產的重組植酸酶產品進行單胃動物飼養中試實驗,浙江農科院蠶研所的家蠶BEVS生產的漁用生長激素飼養實驗。由于昆蟲和哺乳動物在進化上分歧很遠,同源性很差,交叉反應少,對人不存在潛在的生物危害,其表達產物用于免疫學檢驗具有天然的優勢,國外許多生物試劑盒中的標準晶(陽性對照)大部分為BEVS生產的產品。用家蠶BEVS生產的乙肝核心抗原、丙肝核心抗原等均應用于診斷試劑盒。相信隨著時間的推移,BEVS系統用途會日益擴展。特別是在藥理學、人體病理學、昆蟲生理生化學、生物藥學及工程病毒殺蟲劑開發研究方面的應用將會更加引人注目。

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